ELISA法HBsAg假陽(yáng)性和假陰性

  為了減少HBsAg檢測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，我們有必要對(duì)這種現(xiàn)象的原因進(jìn)行分析，在實(shí)際的檢測(cè)工作中，造成HBsAg檢測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性主要受以下因素影響，分述如下：

一、ELISA法假陰性原因

1. 標(biāo)本用肝素或EDTA等抗凝處理易造成HBsAg檢測(cè)結(jié)果假陰性，肝素抗凝血漿會(huì)增加OD值,可能與高濃度肝素具有強(qiáng)大的負(fù)電荷,能吸附酶標(biāo)記物不易洗脫有關(guān)；EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中的辣根過(guò)氧化物酶活性，造成假陰性。


2. 標(biāo)本保存不當(dāng),在冰箱內(nèi)保存過(guò)久的標(biāo)本,血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體。標(biāo)本放置時(shí)間延長(zhǎng)（如一天以上），有時(shí)抗原或抗體免疫活性減弱，便出現(xiàn)假陰性。因此若采血后不能及時(shí)檢測(cè)，5天內(nèi)檢測(cè)標(biāo)本分離血清置于4。C冰箱內(nèi)；超過(guò)5天不能檢測(cè)的，應(yīng)放在-20。C低溫冰箱中。


3. 低濃度HBsAg標(biāo)本（弱陽(yáng)性HBsAg）易受加樣時(shí)間（特別是大批量標(biāo)本）、試劑平衡時(shí)間、溶血程度的影響，出現(xiàn)假陰性。如加樣時(shí)間在30分鐘內(nèi)的差異是zui大的。


4. 高濃度HBsAg在ELISA一步法檢測(cè)中易出現(xiàn)假陰性，即HBsAg的鉤狀效應(yīng)。從原理來(lái)講，一步法中HBsAg與包被板上的HBsAb及酶結(jié)合的HBsAb結(jié)合是雙向的，當(dāng)HBsAg濃度過(guò)高時(shí)，HBsAg與包被板上的抗體及酶結(jié)合物中的抗體均是單向結(jié)合，不能形成抗體－抗原－抗體酶復(fù)合物，使酶標(biāo)記抗體在隨后的洗板中洗掉，從而顯出陰性結(jié)果。但是在ELISA兩步法中，高濃度的HBsAg只能與包被的HBsAb“飽和"地結(jié)合，多余部分被洗掉，隨后加入的酶結(jié)合的HBsAb正好通過(guò)HBsAg的“橋梁"作用而結(jié)合在酶標(biāo)板上，顯示陽(yáng)性結(jié)果。因此當(dāng)HBsAg強(qiáng)濃度時(shí)用ELISA一步法檢測(cè)存在假陰性現(xiàn)象。解決此問(wèn)題的zui hao辦法有：對(duì)標(biāo)本進(jìn)行稀釋；不單檢測(cè)HBsAg；采用ELISA兩步法檢測(cè)可消除漏檢現(xiàn)象。


5. 由于慢性病毒攜帶者(低水平HBsAg攜帶者)或HBV感染的潛伏期,HBsAg濃度低于檢測(cè)水平的下限，由此造成假陰性。


6. S基因突變導(dǎo)致HBsAg的氨基酸結(jié)構(gòu)改變，由于多數(shù)商用試劑盒檢測(cè)系統(tǒng)采用的為多克隆抗體檢測(cè)HBsAg的a決定簇，這一區(qū)域的點(diǎn)突變即可導(dǎo)致臨界觀測(cè)值或陰性結(jié)果，造成假陰性。


二、ELISA法假陽(yáng)性原因

1. 溶血或紅細(xì)胞：有國(guó)內(nèi)報(bào)道酶免HBsAg試劑檢測(cè)溶血標(biāo)本時(shí)可造成假陽(yáng)性，因紅細(xì)胞破壞溶解時(shí)釋放出大量血紅蛋白，血紅蛋白的亞鐵血紅素具有弱過(guò)氧化物酶活性，其作用效應(yīng)與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）類似，能與預(yù)包被抗體（Ab）結(jié)合，一步法洗脫步驟往往難以wan全洗脫，殘留的過(guò)氧化物酶催化底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB）產(chǎn)生假陽(yáng)性。因此在采集血標(biāo)本時(shí)，量不能太少，操作過(guò)程中如果血清混濁，一定要離心后再吸樣，避免紅細(xì)胞加入造成假陽(yáng)性。對(duì)于溶血的標(biāo)本zui重新采集血液，進(jìn)行重新檢測(cè)。


2.  標(biāo)本凝集不全或標(biāo)本離心處理時(shí)采用不同的離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間,也可造成假陽(yáng)性結(jié)果。若在血液還未開始凝固時(shí)即強(qiáng)行分離血清，此時(shí)的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過(guò)程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽(yáng)性結(jié)果；離心轉(zhuǎn)速過(guò)低或離心時(shí)間過(guò)短，由于血液離心不充分均可導(dǎo)致假陽(yáng)性。解決的辦法zui是血液標(biāo)本采集后放水浴箱，使其充分凝固再用3000rpm,離心15分鐘再分離血清。


3. 干擾物質(zhì)的影響：如類風(fēng)濕因子（RF）、補(bǔ)體、AFP等可以造成HBsAg檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性。RF因子可與標(biāo)記二抗的Fc段結(jié)合造成假陽(yáng)性；補(bǔ)體從C1q活化，使一抗和酶標(biāo)二抗的抗體分子發(fā)生變構(gòu)，F(xiàn)c的C1q分子結(jié)合點(diǎn)暴露出來(lái)，則補(bǔ)體C1q可將二者連接起來(lái)造成假陽(yáng)性，采用56。C30分鐘滅活補(bǔ)體可降低假陽(yáng)性率；高濃度的AFP（如孕婦），在儲(chǔ)存過(guò)程中可能形成二聚體會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深造成假陽(yáng)性結(jié)果。


4. 某些細(xì)菌污染標(biāo)本(如表皮球菌等),菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，造成檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性。